Dieter Untergasser: Microscopia pratica. Cap 11.

Giovedì, 14 Dicembre, 2019.

11.1. Il microscopio
Lo strumento di lavoro più importante  per la diagnosi di malattie dei pesci è il microscopio. Per l'esame di raschiati, preparati di parassiti e di organi è praticamente indispensabile. I microscopi didattici sono sì economici, ma non utilizzabili per questi lavori; in genere, non dispongono di attacchi standard e l'ottica è insoddisfacente. Per questa ragione proprio i bambini e gli adolescenti perdono presto l'interesse oppure, se contro ogni aspettativa questo non accade, dopo un po' si acquista un apparecchio di alta qualità. I prezzi di un microscopio valido con attacchi standard  vanno da 1,5 a 4 milioni di lire. Il costo elevato spaventa facilmente. Se, tuttavia, si considera che un tale strumento non è sottoposto ad usura se trattato correttamente, l' investimento non è troppo gravoso: un buon microscopio è un acquisto per tutta la vita. Ogni produttore di microscopi permette di iniziare con un'attrezzatura e di ampliarla via via, a seconda dei mezzi a disposizione. Questo capitolo non offre lo spazio per poter dare un'introduzione all'uso di un microscopio. Al principiante si consiglia pertanto di studiare attentamente le istruzioni accluse ad ogni microscopio. Acquistando un microscopio si dovrebbe fare attenzione che i raccordi siano di tipo standard o, comunque, sia effettivamente disponibile una certa gamma di accessori montabili sul proprio modello. Se la lunghezza del tubo è di 160 mm, sono utilizzabili accessori di molte case. Nei barilotti degli obiettivi è incisa la lunghezza  del tubo necessaria. Per iniziare sono sufficienti tre obiettivi con ingrandimenti propri di 10, 20 e 40 volte.  A ciò si aggiungono tre oculari con ingrandimenti di 5, 10 e 15 volte. L'ingrandimento massimo di 600 volte, così raggiunto, è quanto basta per l' esame di parassiti dei pesci. Se in un secondo momento si approfondirà ulteriormente la materia, l'attrezzatura potrà essere ampliata con l'acquisto di obiettivi con ingrandimenti di 63 e 100 volte. Per quanto concerne lo stativo del microscopio esistono due sistemi. In alcuni modelli per la messa a fuoco si muove il tubo, in altri invece si muove il tavolino portaoggetto. Sono più stabili e robusti gli stativi con tubo fisso e tavolino mobile. Oltre alla normale illuminazione in campo chiaro esistono altri metodi di osservazione. I più noti sono l' osservazione in campo oscuro e l'osservazione a contrasto di fase. Mentre per costruire un congegno per l'osservazione a contrasto di fase ci vuole l'intervento di una persona  già esperta di microspia, che abbia nozioni di meccanica fine, un dispositivo per l'osservazione in campo oscuro a ingrandimento fino a 400 volte che si può approntare con facilità in casa. Daun foglio di cartoncino nero si tagliano alcun cerchi di vario diametro. Il diametro di questo diaframma centrale sarà maggiore per obiettivi più potenti, minore per quelli deboli. I diaframmi vengono collocati uno dopo l' altro al centro di una piccola lastra di vetro o di una pellicola trasparente che si alloggerà nel portafiltro. Dipendentemente dall' apertura  del diaframma del condensatore si crea un campo luminoso rotondo di vario diametro (fig. 109). Si sperimenta coi diversi diaframmi fino ad ottenere un' immagine, su cui gli oggetti risplendono chiari. In questo modo ad ogni ingrandimento di 400 volte si distinguono bene anche i batteri più minuscoli. Questo impressionante effetto si spiega dal fatto che la luce anulare viene trasformata dal condensatore in un cono cavo, la cui punta è situata sul piano dell'oggetto. Sopra questo piano si trova un analogo cono cavo formato dalla luce, la cui punta invece è rivolto verso il basso. Allargandosi il cono verso l'alto, la luce diretta passa ai lati dell' obiettivo. Nel campo visivo c'è oscurità, mentre gli oggetti deviano nell' obiettivo la luce che li attraversa, e quindi appaiono chiari. Tutte le immagini in campo oscuro pubblicate in questo libro sono state ottenute con questi diaframmi “fai da te”.
11.2. Misurazioni con il microscopio
Nelle descrizioni, nei disegni e nelle fotografie si devono sempre indicare le dimensioni dell'oggetto. Non si riporta l' ingrandimento al microscopio, bensì le dimensioni dell' oggetto espresse in micrometri. In questo modo si escludono equivoci quando si ha a che fare con fotografie ingrandite in un secondo momento oppure con disegni. L' ingrandimento potrà essere calcolato da chi osserva l'immagine, misurando le dimensioni dell'illustrazione e dividendo il valore per le dimensioni indicate dell'oggetto. Per misurare le dimensioni di un oggetto, è necessario un oculare di misurazione. In questo si trova una scala di 10 mm suddivisa in 100 unità. Per trovare la corrispondenza tra i singoli obiettivi e questa scala, è necessario un micrometro portaoggetto. Siccome viene utilizzato una volta sola, si potrà chiederlo in prestito a qualche conoscente. Il micrometro portaoggetto è un vetrino portaoggetto in cui è incisa una scala di 1 mm suddivisa in 100 unità. Per ogni obiettivo si deve calcolare il rispettivo valore di misurazione per unità di micrometro oculare. Si pone il micrometro portaoggetto sul tavolino e lo si muove in modo tale che gli inizi delle due scale coincidano (fig. 110). Quindi si cerca un punto in cui due striscette corrispondono perfettamente. Più questo valore si trova al termine della scala, più esatto sarà il risultato. Se, ad esempio, 93 unità del micrometroportaoggetto corrispondono a 59 unità del micrometro oculare, si esegue il seguente calcolo:
0,93 mm : 59 unità = 0,01576  mm

0,01576 mm = 15,76 µm per singola unità
Ora, per future misurazioni, sarà sufficiente montare il micrometro oculare, sapendo che un'unità di questa scala corrisponde a 15,76 µm, chiaramente seguendo il nostro esempio, in cui è stato impiegato un obiettivo con ingrandimento proprio di 6,3 volte. Un verme che misura 86 unità sarà lungo 1355 µm o 1,35 mm.
Per i lettori che non dispongono di un micrometro portaoggetto riportiamo di seguito, per alcuni obiettivi, i valori in micrometri corrispondenti ad un'unità di un oculare di misurazione con un ingrandimento  di 10 volte e munito di una scala lunga di 10 mm suddivisa in 100 unità.
Obiettivo   2,5 x 83,2 µm

Obiettivo   4 x 23,8 µm

Obiettivo   5 x 20 µm

Obiettivo   6,3 x 15,8  µm

Obiettivo   10 x   9,8 µm

Obiettivo   16 x   6,3 µm

Obiettivo   20 x   5,1 µm

Obiettivo   25 x   3,8 µm

Obiettivo   40 x   2,44 µm

Obiettivo   63 x   1,68 µm

Obiettivo 100   x 1 µm
I valori oscillano lievemente secondo la casa produttrice degli obiettivi. L'ingrandimento proprio del tubo dev' essere di 1 x.
11.3. Accessori in vetro per allestimenti di preparati
Oltre al microscopio e agli strumenti menzionati nel capitolo 3.1., sono necessari alcuni articoli in vetro. Per prima cosa sono da citare i vetrini portaoggetto e i vetrini coprioggetto. I vetrini portaoggetto sono lastrine di vetro di 76x26 mm. I vetrini coprioggetto hanno uno spessore di 0,17 mm e in genere si tratta di quadratini con lati di 18 o 22 mm, oppure sono rotondi. Le pipette in vetro si possono approntare in casa da  tubicini in vetro che vengono sfilati usando un cannello per saldare (fiamma ossidrica). Quindi si incide alla lunghezza desiderata con una limetta per fiale e si spezza la pipetta. Poi si applica all'estremità non affinata della pipetta un piccolo palloncino aspirante di gomma (peretta). Con le pipette graduate si possono misurare piccole quantità di liquido fino a 0,1 ml. Un cilindro graduato con un volume di 100 ml serve per determinare con precisione quantità maggiori di liquido. Due o tre vaschette di vetro (per esempio capsule di Petri) sono necessarie per osservare oggetti piccoli sotto la lente d'ingrandimento. Cinque vasetti per preparati, bassi e con tappo smerigliato a chiusura termica, servono come recipienti quando si allestisce e si colora il preparato. A questo scopo bastano anche delle piccole capsule di Petri (diametro 60 mm) con coperchio.
11.4. Preparati vivi
Lo strumento più costoso sarà privo di valore se non si è in grado di adoperarlo correttamente. Per esercitarsi con il microscopio o comunque prendere un po' di confidenza, si allestisce innanzi tutto un preparato molto semplice. Si pone una piccola goccia di acqua su un vetrino portaoggetto e vi si immergono alcuni filamenti di alga. Quindi si copre con un vetrino portaoggetto. Ci vuole un po' di pratica per non includervi anche delle bollicine d'aria. Per evitare ciò, si tiene il vetrino coprioggetto tra pollice e indice oppure con una pinzetta sopra il vetrino portaoggetto, formando un angolo di 45 gradi in cui è alloggiato il campione; quindi si tira lentamente indietro il coprioggetto finchè l'orlo tocca la goccia di acqua. Ora l'acqua si spande lungo il bordo di contatto sotto il vetrino portaoggetto. Adesso si abbassa lentamente e in maniera uniforme l'altro bordo del vetrino coprioggetto in modo che l'acqua del campione sposti l'aria senza includere le bolle. In un preparato riuscito lo spazio tra il vetrino coprioggetto e quello portaoggetto non dev' essere molto più alto del coprioggetto stesso. Quando si vuole allestire un preparato di un oggetto più spesso, si deve riempire d' acqua lo spazio rimasto vuoto sotto il vetrino coprioggetto. A certi ingrandimenti più elevati, i preparati troppo spessi non si possono illuminare a sufficienza e la messa a fuoco riuscirà solo con lo strato superiore, sotto il vetrino coprioggetto. Questo è dovuto al fatto che la profondità di campo si riduce aumentando l' ingrandimento. Per comprendere il concetto della profondità di campo, ci si immagini uno strato più o meno sottile che attraversa l' oggetto in senso parallelo al vetrino coprioggetto e in cui all' occhio dell' osservatore tutto risulta a fuoco. Inizialmente si deve fare un po' di pratica prima di riuscire a sistemare le dimensioni della goccia d' acqua in cui alloggiare l'oggetto. I filamenti di alga sono buoni oggetti d'esercizio, perchè danno dei preparati molto sottili. L' acqua in ecceso può essere tolta lungo i margini del vetrino coprioggetto con della carta assorbente. Quando si tratta di oggetti abbastanza piccoli, si deve fare attenzione che questi non vengano trascinati nella carta dalla corrente dell' acqua. Allo stesso modo si procederà con altri preparati a fresco e con raschiati. Ora si poggia il preparato sul tavolino portaoggetto del microscopio. La regolazione dell' illuminazione ottimale si desume dalle istruzioni accluse al microscopio. Si tenga presente che va evitato qualsiasi contatto del preparato o delle dita con la lente frontale dell' obiettivo, poiché altrimenti questa si graffia o si unge. Quindi, per una prima messa a fuoco, l'obiettivo non viene mai spostato verso il preparato, bensì lo si allontana. Dapprima tra lente frontale dell' obiettivo e vetrino coprioggetto si regola la distanza più piccola che si riesca ancora a distinguere guardando in senso orizzontale a livello del tavolino portaoggetto. Poi si osserva attraverso l'oculare e si aumenta con la manopola per il movimento macrometrico la distanza finchè il preparato, sfocato, appare nel campo visivo. Ora si mette a fuoco con la manopola per il movimento micrometrico. Per la pratica con pesci morti, prima di iniziare con la dissezione si consiglia di preparare alcuni vetrini portaoggetto con goccia d'acqua su cui poi trasferiremo i raschiati o i frammenti di materiale. Anche i vetrini portaoggetto devono essere pronti per l'uso, puliti, asciutti e privi di grasso (senza impronte digitali). Il vetrino portaoggetto e quello coprioggetto vengono presi con le dita solo ai bordi,  mai sulle superfici. Molti vetrini portaoggetto e coprioggetto vengono offerti in commercio già puliti, ma ciò non basta per ottenere dei buoni preparati. Si può rimediare riempiendo un piccolo recipiente con dell'alcol etilico al 95% dove conserveremo una scorta di vetrini. In caso di necessità possono essere prelevati con una pinzetta e asciugati con un piccolo panno morbido ed assorbente. Se questa operazione risulta troppo complicata, si può riempire un secondo recipiente a chiusura ermetica con del cloroformio; qui sciacqueremo nuovamente i vetrini dopo averli tolti dall'alcol etilico. Tenendo poi con una pinzetta i vetrini all'aria per alcuni secondi, il cloroformio ancora aderente evapora e si avranno vetrini portaoggetto e coprioggetto puliti e sgrassati. Una volta usati, sia i vetrini portaoggetto che i coprioggetto si puliscono solo se non sono troppo sporchi. Questo in genere è il caso di preparati a fresco inclusi in acqua. Se gli oggetti sono stati fissati e colorati, è quasi troppo complicato pulire il vetro portaoggetto.  Al principiante risulta difficile pulire i vetrini coprioggetto; solitamente si rompono quando vengono asciugati. A chi vuole occuparsi intensamente con le malattie dei pesci non può bastare l'esame salutario di qualche pesce malato. Uno studio approfondito dei microrganismi e dell'idrobiologia in generale è la premessa per imparare a distinguere i parassiti da organismi innocui e identificare le cause di malattie. Questo processo di apprendimento certo non è noioso, e chi una volta ha osservato con un buon microscopio i microrganismi in una goccia d'acqua trarrà sempre soddisfazioni dalla microscopia. Materiale di fondo e filtro dell'acquario sono vere miniere inesauribili per chi vuole imparare a conoscere protozoi innocui, vermi e artropodi. Gli oggetti trovati si possono poi determinare, ad esempio, in base all'Atlante dei microrganismi acquatici (vedi bibliografia). Le figg. 111-115 mostrano alcuni di questi innocui abitanti dell'acquario.
11.5. Preparati per schiacciamento e per sfilacciatura
Per rendere gli organi accessibili all'esame microscopico, si prelevano alcuni frammenti delle dimensioni di una capoccia di spillo. Questi vanno poi resi trasparenti, in altre parole la luce deve poterli attraversare. Inoltre, i preparati devono essere molto sottili,per offrire immagini a fuoco. Si trasferiscono i frammenti di organo in una goccia di soluzione fisiologica di sale da cucina (0,64%) sul vetrino portaoggetto e qui si sfilacciano con due aghi appuntiti fino ad ottenere particelle più minute possibili. Se, dopo aver apposto il vetrino coprioggetto, il preparato risultasse troppo spesso, si può premere con un oggetto ottuso e pulito sui punti del  vetrino coprioggetto in cui si trovano i pezzi più grossi. Ora si sistema il preparato sul tavolino portaoggetto e si inizia l'esame con l'ingrandimento più basso. Nel capitolo 3 con la descrizione degli organi è indicato in quali casi approntare preparati per sfilacciatura o per schiaccimento. I preparati per schiacciamento richiedono un intervento un po' energico. Tra due vetrini portaoggetto incrociati, senza acqua, si preme il frammento di organo, finché è disteso in uno strato sottilissimo. Quindi si dividono i due vetrini senza farli scivolare l'uno contro l'altro. Sul fine strato di materiale si aggiunge un po' di acqua , poi si appone sul preparato un vetrino coprioggetto.
11.6. Come isolare gli agenti patogeni
Se in un preparato a fresco sono stati trovati uno o più parassiti, talvolta è il caso di trasferirli in un nuovo preparato. Possono esserci vari motivi per questa operazione. Forse si vuole osservare più in dettaglio il parassita oppure si desidera fotografarlo come oggetto accuratamente isolato. Anche quando si vogliono allestire dei preparati permanenti, i parassiti devono essere prelevati dal preparato a fresco e quindi trattati. Si pone il vetrino portaoggetto su una lastra di vetro illuminata dal basso. Come fonte di luce si usa, per esempio, una lampadina ad incandescenza (lampada da scrivania), la cui luce viene condotta tramite  uno specchio attraverso la lastra di vetro e il preparato (fig. 116). Davanti allo specchio si può sistemare un foglio di carta da lucidi (per disegno; in cartoleria) per creare una luce diffusa. Osservando ora dall'alto con una forte lente d'ingrandimento il preparato, si distinguono i parassiti. E' comodo usare una lente d'ingrandimento fissa, in modo che entrambe le mani restino libere. Con cautela si alza il vetrino coprioggetto con una pinzetta appuntita. Se sotto il vetrino coprioggetto è rimasto attaccato del materiale, lo si toglie con un ago per dissezione e si striscia sul vetrino portaoggetto. Risulta più semplice trasferire il materiale dai vetrini portaoggetto e coprioggetto in una vaschetta bassa (per esempio una capsula di Petri) con 2-3 ml di soluzione fisiologica di sale da cucina (preparazione vedi capitolo 10.3., C 12). Ora si prendono due aghi per dissezione e si liberano i parassiti dal tessuto circostante. I pezzi di intestino vengono sfilacciati oppure incisi in senso longitudinale. Molti parassiti sono conservabili in questa soluzione per varie ore, sicché non è necessario affrettarsi con le successivi operazioni. Impiegando una pipetta molto fine si possono aspirare i parassiti singolarmente e trasferirli su vetrini portaoggetto puliti, in una piccola goccia di soluzione di sale da cucina. Dopo aver chiuso con un vetrino coprioggetto, si osserva al microscopio con un ingrandimento di 100-300 volte. Può accadere facilmente che i parassiti più grandi vengano schiacciati con il vetrino coprioggetto. Per questo motivo è consigliabile evitare, mediante distanziatori, che il vetrino coprioggetto aderisca troppo. Si usa a questo scopo un po' di plastilina, di cui con i quattro angoli del vetrino coprioggetto si prelevano dei frammenti che così resteranno attaccati al vetrino. Questo viene ora posato, con i piedini di plastilina in basso, sul vetrino portaoggetto con il parassita. Poi con cautela si preme con un ago sui quattro angoli finchè il parassita resta incastrato. L'acqua mancante viene aggiunta dai bordi. Adesso l'oggetto potrà essere osservato al microscopio. I parassiti estremamente piccoli, come flagellati nell'intestino e nel sangue, non sono più visibili sotto la lente d'ingrandimento. Perciò il preparato coperto viene posto ancora una volta sul tavolino portaoggetto del microscopio e nel campo illuminato si cerca, con un obiettivo dall'ingrandimento debole, una zona che presenti molti flagellati. In questo punto si aspira un po' di liquido con una pipetta finissima. Si trasferisce il materiale in una minuscola goccia di soluzione fisiologica di sale da cucina precedentemente posta su un vetrino portaoggetto. Un simile preparato diventa molto sottile, sicché può essere osservato anche ad un ingrandimento molto elevato. Talvolta è necessario conservare per alcuni giorni dei preparati a fresco, in modo da poter seguire l'ulteriore sviluppo degli agenti patogeni. Li si pone in un ambiente unico per evitare che l'acqua evapori.  E' sufficiente un vasetto di vetro a chiusura ermetica, con 2 cm di acqua sul fondo. I vetrini portaoggetto vengono sistemati su una base che sporga di poco dalla superficie dell'acqua. Per l'esame al microscopio basterà pulire la parte inferiore del vetrino portaoggetto.
11.7. Istruzioni generali per la preparazione
Molte delle sostanze chimiche citate nei capitoli 11.7 e 11.8 devono essere assolutamente tenute in luoghi non accessibili ai bambini. Sono velenose se ingerite o inalate oppure sono corrosive. Gli alcoli ed i solventi sono facilmente infiammabili e i loro vapori formano con l'aria delle miscele esplosive. Si osservino scrupolosamente le avvertenze del produttore. I rivenditori e ogni persona qualificata (chimici, biologi e simili) potranno dare ulteriori consigli. Si legga anche il capitolo 10.1. In molti casi si rileva necessario conservare i parassiti per periodi più o meno lunghi: o perché li si vuole tenere per un paragone successivo o perché si desidera affidarli ad un professionista per la classificazione. Il problema è conservare gli organismi microscopici fino al momento in cui vengono identificati. A questo scopo vengono conservati in miscele di solventi oppure si allestiscono preparati permanenti. Durante le operazioni di preparazione si possono anche colorare. Per ottenere un preparato permanente sono necessari vari passaggi di lavoro. Il primo è la fissazione. Con l'apposito fissativo (liquido fissatore), in cui viene posto l'oggetto, si uccidono le cellule, mentre il tessuto resta morfologicamente stabile come vivo, cioè non si decompone. Gli organismi interi non devono perdere la loro forma. Inoltre, il fissativo ha il compito di preparare l'oggetto per le successive operazioni. Esso fa coagulare le proteine, in modo che le membrane cellulari diventino permeabili e i coloranti possano penetrare nelle cellule. Per questo motivo in nessun punto gli oggetti immessi nel liquido devono essere più spessi di 1 cm. La quantità di liquido necessaria corrisponde a 50-100 volte il volume dell'oggetto. La miscela di fissazione deve agire per un determinato periodo e va usata una volta sola. Dopo la fissazione è talvolta necessario asportare nuovamente il fissativo dall'oggetto. A tale scopo si collocano per un po' di tempo gli oggetti in acqua distillata o in alcol. Nelle seguenti istruzioni per la preparazione sono indicati esattamente i singoli passaggi operativi e i tempi di permanenza degli oggetti nelle soluzioni. In base a questi dati, anche il principiante sarà in grado di allestire dei preparati validi. Egli avrà, quindi, la possibilità di spedirli, ai fini della determinazione, ad un laboratorio, ad un istituto universitario di medicina veterinaria o ad un istituto zooprofilattico. Siccome la fissazione deve essere eseguita rapidamente, gli oggetti più grandi vengono immersi in un recipiente già pronto con il liquido fissatore. Per il trasferimento degli oggetti si usa una pinzetta fine (acciaio per molle), oppure si aspira con una sottile pipetta. E' necessario che nel fissativo giunga meno acqua possibile. I vermi (nematodi) si possono catturare e trasferire agevolmente anche con un ago per dissezione. Gli oggetti di cui si vogliono approntare dei preparati contengono moltissima acqua, che va rimossa dato che non si lega ai materiali di inclusione (solitamente resine sintetiche). Per la disisdratazione sono necessari alcoli a varie gradazioni. A seconda del fissativo utilizzato, si inizia con alcol al 20-40% per poi effettuare passaggi in alcol a gradazione crescente del 10-15%, finché gli oggetti si trovano in alcol assoluto. Gli alcoli di varia gradazione si preparano in casa secondo le istruzioni riportate nel capitolo 11.8. e si conservano in flaconi a chiusura ermetica, poiché l'acol assorbe l'umidità dell'aria e quindi si diluisce da solo. Dal fissativo gli oggetti possono essere trasferiti direttamente in un alcol la cui gradazione corrisponda approssimativamente al contenuto di alcol nel liquido fissatore. In tutti i passaggi la quantità di liquido dev'essere 50-100 volte il volume dell'oggetto. Le singole operazioni vengono effettuate in piccole vaschette di vetro, da coprire con un vetrino. Si possono trasferire gli oggetti da gradazione a gradazione oppure si aspira con una pipetta il liquido e si sostituisce con l'alcol della gradazione successiva. Per evitare di asportare alcun oggetto, si controlla durante l'aspirazione l'estremità della pipetta con una lente d'ingrandimento.  In questo modo gli oggetti passano per la serie di alcoli, fino a raggiungere una gradazione del 70%. In questo alcol possono permanere per uno o due giorni. E' ovvio che il recipiente dev'essere chiuso ermeticamente. Gli oggetti che non devono essere colorati passano per le successive gradazioni alcoliche fino ad arrivare alla gradazione del 100%. Per le gradazioni fino al 60% è preferibile utilizzare alcol isopropilico al 100%. Lo si diluisce alle gradazioni desiderate come descritto nel capitolo 11.8. L'alcol etilico assoluto, privo di acqua, è troppo caro per i nostri scopi. Gli oggetti vengono trasferiti dall'alcol isopropilico assoluto in xilolo, che verrà cambiato una volta. Dopo il tempo di permanenza prescritto si preparano uno o più vetrini portaoggetto puliti accuratamente, al cui centro poniamo una goccia di mezzo di inclusione. Ora si prelevano gli oggetti dello xilolo e se ne trasferiscono da uno a tre nelle gocce di balsamo. Si possono quindi anche posizionare con un ago. Dopodiché si ricopre con un vetrino coprioggetto pulito senza includervi delle bolle. Il preparato deve giacere per alcune ore o giorni in posizione orizzontale e al riparo dalla polvere, in modo che il mezzo di inclusione possa asciugare. Nei preparati più spessi può accadere che il mezzo di inclusione si restringa. Nei giorni successivi si dovrà allora aggiungere più volte del materiale di inclusione dai bordi del vetrino coprioggetto. Quando non si notano più coartazioni, si toglie con un piccolo panno imbevuto di xilolo il mezzo di inclusione in eccesso dai bordi del vetrino coprioggetto e dal vetrino portaoggetto. Quindi si provvede alla descrizione del preparato. Si possono usare delle etichette autoadesive tagliate appositamente in modo da essere attaccate  sulle superfici libere a destra e a sinistra del vetrino coprioggetto. Sul preparato vanno annotate le seguenti informazioni: su un lato il fissativo, il colorante e il mezzo di inclusione impiegati, sull'altro lato il nome scientifico, la provenienza (in caso di parassiti il nome dell'ospite e l'organo), il nome di chi ha allestito il preparato e la data. Il preparato asciutto può essere munito di un codice e quindi conservato in posizione orizzontale in un'apposita cassetta. Il codice verrà segnato anche sul verbale che fornisce i dati sulla dissezione, che poi si ripone in un classificatore. In questo modo troveremo tutto il materiale disponibile su un determinato caso. La colorazione dei preparati può avere vari motivi. Quello più immediato consiste nel fatto che così gli oggetti sono più facilmente reperibili nel preparato finito. Le colorazioni doppie permettono di distinguere gli organi interni con un altro colore rispetto alle regioni esterne. Il procedimento di colorazione dipende dal fissativo usato precedentemente e dal colorante. Se la miscela di fissazione contiene alcol, si può trasferire l'oggetto direttamente in un colorante disciolto in alcol. Se si vuole lavorare con un colorante disciolto in acqua, si deve seguire la serie discendente dellr gradazioni alcoliche, finché gli oggetti nuotano in pura acqua distillata. Dopo il tempo necessario per la colorazione si risale la serie degli alcoli; quindi, passando per lo xilolo, gli oggetti vengono trasferiti su un vetrino portaoggetto nel mezzo di inclusione e poi si ricopre con un vetrino coprioggetto. Se l'oggetto è rimasto troppo a lungo nella soluzione colorante ed è diventato opaco (sovracolorato), si può asportare il colore in eccesso mediante determinati liquidi. Questo procedimento è detto differenziazione. Quindi si controcolora oppure si disidrata mediante la serie ascendente degli alcoli fino ad arrivare allo xilolo, dopodiché si monta in resina sintetica. I tempi di permanenza nelle soluzioni coloranti e nei vari alcoli indicati più avanti sono valori medi, che possono essere modificati secondo le proprie esperienze e le dimensioni dell'oggetto. Se i preparati devono essere conservati per più di alcune settimane, è necessario chiudere ermeticamente la fessura tra il bordo del vetrino coprioggetto ed il vetrino portaoggetto. A questo scopo si usa il luto. Questo viene applicato più volte lungo il bordo del vetrino con un piccolo pennello, in modo che sporga e il vetrino coprioggetto sia unito senza fessure al vetrino portaoggetto. In questo modo il preparato è conservato  in maniera duratura. L'allestimento dei preparati di microrganismi è un lavoro interessante per chi applica la microscopia. Col tempo si otterrà una preziosa raccolta di preparati permanenti, sempre disponibili per effettuare dei confronti. Occasionalmente, ci si dovrebbe esercitare con l'allestimento di preparati riccorendo ad oggetti comuni, in modo da non rovinare parassiti più rari. 
11.8. Istruzioni specifiche per la preparazione
Chi vuole allestire preparati permanenti di parassiti dei pesci e di altri organismi, deve disporre di un armamentario base di sostanze chimiche e di coloranti. Sono necessari: 1 l di alcol etilico al 95%, 1 l di acqua distillata, 1 l di alcol isopropilico al 100%, 250 ml di formalina al 35-40%, 250 ml di xilolo, 250 ml di acido lattico, 100 ml di glicerina, 100 ml di acido acetico glaciale al 100%, 100 ml di acido cloridrico al 25%, rispettivamente 100 ml delle soluzioni coloranti blu di metilene di LÖFFLER e carminio boracico alcolico e 5-10  g della sostanza colorante verde metile. Inoltre ci vogliono i vari mezzi di inclusione come la glicerina-gelatina di KAISER, il polivinil-lattofenolo, il balsamo del Canada, nonché il luto per sigillare i vetrini coprioggetto. Per la colorazione dei batteri sono inoltre necessari: soluzione di fucsina fenicata di ZIEHL-NEELSEN, blu di metilene di  ZIEHL-NEELSEN, alcol acidificato con acido cloridrico, violetto di genziana fenicato di GRAM, soluzione acquosa di iodio e ioduro di potassio di GRAM (1:2:300) e soluzione di fucsina di GRAM. Un cilindro graduato del volume di 100 ml con unità di 1 ml è necessario per misurare i liquidi. Innanzi tutto si preparano gli alcoli di diversa gradazione. Si parte dall'alcol etilico al 95%. Se di questo alcol vogliamo ottenere un alcol al 30%, si versano 30 ml dell'alcol  al 95%, nel cilindro graduato e si riempie con acqua distillata fino al segno dei 95 ml. Per preparare dell'alcol al 60% si versano 60 ml di alcol etilico al 95% e si aggiungono 35 ml di acqua distillata. Con questo metodo, dall'alcol etilico al 95% prepareremo alcoli al 30%, 40%, 50%, 60%. Questi liquidi vanno conservati in flaconi chiusura ermetica i quali, a loro volta, dovranno essere muniti di etichetta. Le gradazioni superiori verranno approntate con alcol isopropilico al 100%. Se ne prendono 70 ml e si allunga con acqua distillata fino a 100 ml, ottenendo così dell'alcol isopropilico al 70%. Di questo alcol sono necessarie gradazioni al 70%, 80%, 90%, 95%, 100%. Quindi si produce un liquido fissatore (E 1) in cui è possibile conservare per anni dei vermi. A 100 ml di alcol etilico al 95% vengono aggiunti 30 ml di formalina, 5 ml di acido acetico glaciale e 200 ml di acqua distillata; il tutto viene miscelato bene e conservato in flaconi a chiusura ermetica. Artropodi come crostacei, acari, insetti e larve di insetti vengono fissati in una miscela al 90% di alcol etilico al 95% e 10% di alcol lattico (E 2). In questo liquido possono essere conservati per alcune settimane. Si potranno spedire gli oggetti ai fini di determinazione conservandoli con liquidi citati nelle bottiglie prive di aria. 
11.8.1. Preparati permanenti in polivinil-lattofenolo (PVL), E 3
Prima di essere montato in PVL, il materiale fissato secondo E 2  va trasferito in acido lattico puro. Questo può avvenire gradatamente, passando gli oggetti per una serie di miscele di alcol e acido lattico a concentrazione crescente di quest'ultimo. Di regola sono sufficienti quattro passaggi. La prima gradazione è al 25% di acido lattico ed al 75% di alcol, la seconda al 50% di acido lattico ed al 50% di alcol, la terza all'80% di acido lattico ed al 20%di alcol, infine si passa al 100% di acido lattico. Siccome l'acido lattico ha un effetto chiarificante, gli oggetti permangono nell'ultimo liquido finché risultano diafani, quindi vengono trasferiti in PVL. Gli artropodi delicati possono restare nelle prime due miscele per alcune ore. Il terzo o quarto passaggio non devono tuttavia durare più di tre ore ciascuno. Si controlla di tanto in tanto la chiarificazione con una lente d'ingrandimento, quindi la si interrompe includendo il materiale in PVL. Non è necessario che gli organismi siano particolarmente chiari, poiché col tempo anche nel preparato finito si schiariscono un po'. L'acaro mostrato  nella fig. 104 è stato trattato con questo metodo. Un altro sistema per trasferire gli organismi dal fissativo in acido lattico puro è più indicatore per oggetti insensibili. In un piccolo vasetto cilindrico si versa un po' di acido lattico e si aggiungono gli oggetti con il liquido fissatore. La quantità di fissativo non deve essere superiore ad un quarto della quantità di acido lattico. Gli organismi scendono lentamente nell'acido lattico e, quindi, possono essere trasferiti direttamente in PVL. Per l'inclusione si pone una grossa goccia  di PVL su un vetrino portaoggetto pulito. Ora, con un ago, si trasferiscono gli animali dall'acido lattico nel PVL e si chiude con un vetrino coprioggetto. In caso di oggetti più grandi, si devono applicare agli angoli del vetrino coprioggetto dei distanziatori in cera o plastilina. Il preparato viene conservato in posizione orizzontale, aggiungendo, se necessario, quotidianamente del PVL dal bordo del vetrino con coprioggetto. Il terzo giorno si attende che si sia asciugato il PVL aggiunto per ultimo, quindi con un coltello affilato si asporta il mezzo di inclusione in eccesso e si luta il vetrino coprioggetto. Se si aspetta troppo, possono verificarsi coartazioni. Per esercitarsi sono adatti oggetti come pulci d'acqua e piccoli insetti.
 11.8.2. Preparati permanenti in balsamo del Canada, E 4
Questo sistema di allestimento dei preparati è molto indicato per vermi nastriformi e artropodi. I nematodi sono un po' più delicati e si raggrinzano facilmente, perciò con questi si deve procedere con molta cautela se si segue il presente metodo. I parassiti isolati dal pesce vengono fissati per almeno 24 ore secondo E 1. In  questo fissativo si possono conservare anche per mesi. Se gli oggetti devono essere colorati, è necessario dell'alcol acido. La preparazione è semplice: su 100 ml di alcol al 70% (diluire solamente dell'alcol etilico o isopropilico assoluto) si aggiungono 2 ml di acido cloridrico. Il trattamento degli oggetti avviene secondo lo schema riportato di seguito:
1   Fissare secondo E 1, almenoper 24 ore.
2   Trasferire il alcol al 40%, per 2 ore.
3   Trasferire in alcol al 50%, per 10 minuti.
4   Trasferire in carminio boracico, per 2-5 giorni, a seconda dello spessore.
5   Trasferire in alcol al 50%, per 30 minuti.
6   Trasferire in alcol al 60%, per 10 minuti.
7   Decolorare in alcol acido, per 1-10 ore, a seconda dello spessore.
8   Trasferire in alcol al 70%, per 20 minuti.
9   Trasferire in alcol all' 80%, per 10 minuti.
10 Trasferire in alcol al 90%, per 10 minuti.
11 Trasferire in alcol per 95%, per 15 minuti.
12 Trasferire in alcol al 100%, per 15 minuti, cambiare una volta. 
Se trasferendo direttamente gli oggetti dall'alcol al 100% nello xilolo compaiono coartazioni, si deve procedere per gradi:
13 Trasferire in una miscela al 75% di alcol e 25% dixilolo, per 15 minuti.
14 Trasferire in una miscela al 50% di alcol e 50% di xilolo, per 15 minuti.
15 Trasferire in una miscela al 25% di alcol e 75% di xilolo, per 15 minuti.
16 Trasferire in xilolo al 100%, per 15 minuti.
17 Montare in balsamo.
I vermi grossi e i grandi artropodi permangono più a lungo nei passaggi con xilolo (fino a 2 ore). Se durante l'inclusione nel balsamo improvvisamente l'interno dell'oggetto diventa, a seconda del tipo di illuminazione, nero o bianco, si deve montare con maggiore delicatezza. Si prepara una miscela al 10% di balsamo e 90% di xilolo e la si versa in una piccola vaschetta. Qui gli oggetti permangono finché lo xilolo non sia evaporato al punto da ottenere un materiale di consistenza sciropposa. Ora si può includere in balsamo. Un altro sistema consiste nell'incidere gli oggetti, mentre si trovano nello xilolo, tre o quattro volte con un ago sottilissimo. Il balsamo potrà così penetrare e gli oggetti restano chiari. Se anche questi suggerimenti non permettono di ottenere oggetti traslucidi,si proceda secondo E 3 oppure E 5. Per esercitarsi si possono allestire preparati di pulci d'acqua, copepodi e piccoli vermi. I segmenti di verme nastriforme nella fig. 96 sono stati trattati con questo metodo.
11.8.3. Preparati permanenti in glicerina-gelatina, E 5
Questo tipo di trattamento è molto delicato. E' adatto per tutti gli oggetti che, trattati secondo E 3 o E 4, presentano delle coartazioni oppure diventano troppo chiari. Innanzi tutto si fissa secondo E 1 per 24 ore, quindi si provvede ad un lavaggio di 2 ore in alcol al 50%. Ora si trasferiscono gli oggetti in alcol al 60%, dove permangono per 15 minuti; successivamente, per 1-3 giorni, si possono colorare in carminio boracico alcolico di GRENACHER. Quindi si trasferiscono in alcol al 60%. Se la colorazione è intensa o eccessiva, si può procedere alla differenziazione in alcol acido. Il lavaggio avviene per un'ora in alcol isopropilico al 70%. Nelle gradazioni successive (alcol isopropilico all'80%, 90%, 95%, 100%) gli oggetti permangono rispettivamente per 15 minuti. Per il trattamento successivo, è necessaria una miscela di 95 ml di alcol isopropilico (al 100%) e 5 ml di glicerina. La miscela viene conservata in un flacone a chiusura ermetica. Se ne versano 5 ml in un piccolo contenitore, non troppo basso, vi si pongono gli oggetti e si colloca il recipiente aperto in un luogo caldo, al riparo dalla polvere. L'alcol isopropilico evapora, e gli oggetti si troveranno in glicerina pura dopo alcune ore o giorni. Questo periodo può essere regolato mediante l'estensione della superficie di evaporazione, oppure ricoprendo parzialmente il recipiente. Allo scopo sono molto adatti i contenitori con fondo convesso verso l'esterno, nella cui parte più bassa si raccolgono gli oggetti. Dopo avere prelevato il materiale dalla glicerina ora priva di alcol, lo si può montare direttamente in glicerina-gelatina su un vetrino portaoggetto. Con un piccolo coltello o un raschietto si preleva dal flacone un pezzo di glicerina-gelatina delle dimensioni di una goccia e lo si pone al centro di un vetrino portaoggetto. Questo viene quindi leggermente riscaldato, passandolo molto rapidamente sopra una fiamma. Quando la glicerina-gelatina si è sciolta, i vermi non possono esservi inclusi immediatamente.  Si aspetta prima che la gelatina si sia di nuovo un po' raffreddata. Poi, con un ago, si trasferiscono i vermi dalla glicerina pura nella glicerina-gelatina sul vetrino portaoggetto. Se nel momento in cui si vuole apporre il vetrino coprioggetto la gelatina è già troppo densa, il vetrino portaoggetto può essere di nuovo leggermente riscaldato. Ora il preparato deve trovarsi in posizione orizzontale, finché la glicerina-gelatina non si è indurita. Si asporta il materiale in eccesso fino ad arrivare al vetrino coprioggetto, dopodiché si luta. Nei giorni successivi si dovrà lutare ripetutamente. Per l'esercizio, sono adatti piccoli nematodi prelevati dal terreno, anguillule dell'aceto oppure vermi Grindal provenienti da colture di organismi nutritivi.
11.8.4. Fissazione per colorazione di flagellati e ciliati, E 6
Se si vuole ottenere una prima determinazione di flagellati e ciliati, questi vanno fissati, in modo da riuscire a distinguere la forma della cellula, il nucleo e i flagelli. A tale scopo è indicata la soluzione di verde metile in formalina. Innanzi tutto si prepara la soluzione d'impiego. In un flacone marrone, che si chiuda bene, si immettono 0,1 g di verde metile e si aggiungono 80 ml di acqua distillata. Ora si scioglie il colorante agitando leggermente, quindi si versano 20 ml di formalina (35-40%). Dopo avere miscelato bene tutti i componenti, si può procedere al trattamento. Per la colorazione nucleare di alcuni flagellati è più indicata una soluzione di carminio in acido acetico. Questa, però, distrugge i flagelli. Gli oggetti di partenza sono di regola preparati a fresco con contenuto intestinale, liquido biliare oppure con raschiato di mucosa. Innanzitutto si alza il vetrino coprioggetto e si eliminano tutti i resti di tessuto solidi e spessi. Ora si aggiunge un po' di soluzione fisiologica di sale da cucina e si chiude nuovamente con il vetrino coprioggetto. Se il preparato è troppo alto, si lascia riposare per un breve periodo, finché tramite l'evaporazione dell'acqua lo spessore non sia diminuito. Ora si aggiunge dal bordo del vetrino coprioggetto una piccola goccia della soluzione di verde metile in formalina e si osserva al microscopio, con un ingrandimento di 200-300 volte, come i flagellati muoiono. Quando nel preparato la corrente si è calmata, si cercano degli esemplari isolati e si osservano a massimo ingrandimento. Se si vuole ottenere una colorazione omogenea, si pone su un vetrino portaoggetto una piccola goccia di liquido contenente dei flagellati oppure il raschiato di pelle con un po' d'acqua. Vicino si aggiunge una gocciolina più piccola – di metà volume o di un quarto – di soluzione di verde metile in formalina oppure di carminio in acido acetico. Con un ago si mescolano rapidamente le due gocce, quindi si ricopre con un vetrino coprioggetto. Anche in questo caso, si cerca prima, con un ingrandimento medio, un flagellato ben conservato, dopodiché lo si osserva a massimo ingrandimento. Siccome gli organismi unicellulari fissati secondo questo metodo non si possono conservare, si consiglia di approntarne un disegno o almeno uno schizzo. Utilizzando la soluzione di verde metile in formalina, i nuclei delle cellule sanguigne e delle mucose assumono una colorazione verde-blu, mentre il citoplasma appare verde debole (fig. 85). Se le cellule presentano un colore verde carico, è stata fissata una soluzione fissatrice-colorante. Con la soluzione di carminio in acido acetico i nuclei diventano rossi e il citoplasma rosa.
11.8.5. Colorazione dei batteri
Per colorare dei batteri sono necessari un fornello ad alcol, o un cannello per saldare (a fiamma ossidrica), e un sostegno su cui appoggiare il preparato da trattare. Questo si costruisce con del filo di ferro. Dev'essere tanto alto da permettere di tenervi sotto per breve tempo la fiamma, e tanto largo da potervi sistemare tre o quattro vetrini uno vicino all'altro. Le gambe devono allargarsi verso il basso, in modo che la struttura poggi bene. Essa viene collocata in una bacinella di plastica (come le vasche usate per lo sviluppo di stampe fotografiche), per raccogliere eventuale colorante che cola (fig. 117). Possibili macchie si eliminano con molta difficoltà. Inoltre, i coloranti utilizzati non devono finire nelle tubature dell'acqua di scarico. Si conservano in flaconi ben chiusi, che poi vengono consegnati nei punti di raccolta differenziata dei rifiuti. Una determinazione completa dei batteri è impossibile per il profano. A questo scopo si devono allestire delle colture su particolari terreni. Si devono studiare la crescita e i colori delle colonie in via di sviluppo. Queste rivelazioni sono complesse e vanno effettuate solo da personale qualificato. Tuttavia, l'osservatore dilettante attento sarà in grado di giungere con il suo microscopio, ad una determinazione tale da permettere la scelta dell'antibiotico per combattere la malattia. Innanzi tutto si individuano le dimensioni approssimative e il tipo di movimento dei batteri (capitolo 4 e 1, tavola 21). Le dimensioni esatte verranno determinate solo in un secondo momento, con il preparato fissato e colorato. Ora, con il materiale liquido contenente batteri si effettuano degli strisci. Dagli organi si prelevano dei frammenti che vengono poi schiacciati con forza tra due vetrini portaoggetto incrociati, dopodiché con questi due vetrini si esegue la stessa operazione utilizzando altri due vetrini puliti. Si otterranno quattro sottilissimi preparati per schiacciamento. Le ciste tubercolari isolate vengono trattate in questo modo. A questo punto i vetrini portaoggetto vengono fatti asciugare all'aria per circa due ore. Poi si provede alla fissazione tramite fiamma: si tiene il vetrino portaoggetto con il materiale in alto tra pollice e indice e lo si passa tre volte rapidamente attraverso la fiamma ossidrica luminosa. La parte inferiore del vetrino portaoggetto deve riscaldarsi atal punto che, ponendola velocemente sul dorso della mano, si avverte un forte calore, senza tuttavia bruciarsi. Se il lato con il materiale cambia colore, fuma o produce un forte odore, la fissazione è stata troppo calda. I preparati dovranno essere trattati fino a questo punto, per poter passare alle due tecniche di colorazione descritte di seguito. 
11.8.6. Colorazione di Gram, E 7
Si prendono uno o più preparati fissati e li si poggia sul sostegno in filo di ferro per effettuare la colorazione di GRAM. I preparati devono trovarsi in posizione orizzontale, in modo che il colore non goccioli dai vetrini. I tempi citati in questa descrizione schematica possono essere leggermente modificati a seconda delle proprie esperienze. Per scolare la soluzione colorante, si prende il vetrino portaoggetto non con le dita, bensì con una pinzetta, poiché anche la pelle si colora intensamente. Lo striscio viene completamente coperto con una soluzione di violetto di genziana fenicato. Dopo tre minuti, si tiene per un po' il vetrino portaoggetto in posizione obliqua, in modo che il colore possa defluire. Ora, il più rapidamente possibile, si aggiunge un po' di soluzione acquosa di iodio e ioduro di potassio, si scola e si aggiunge di nuovo. Questa soluzione deve agire complessivamente per 80 secondi. Dopo la sgocciolatura, si agita lentamente il vetrino portaoggetto per 60 secondi in una bacinella riempita di alcol etilico al 95%. Per far defluire il liquido,  si appoggia con il bordo più lungo il vetrino in posizione verticale su carta assorbente. Quindi lo si lascia asciugare in posizione orizzontale per alcuni minuti e si controcolora per 80 secondi con soluzione di fucsina di GRAM. Dopo un lavaggio sotto abbondante acqua corrente si lascia asciugare lo striscio all'aria, dopodichè si aggiunge una piccola goccia di balsamo e si appone un vetrino coprioggetto. Lo spazio tra vetrino coprioggetto e stroscio dev'essere molto sottile, in modo da poter lavorare anche con obiettivi ad immersione in olio. Diluendo il balsamo con un terzo di xilolo, lo spazio tra i vetrini coprioggetto e portaoggetto si riduce. I batteri Gram-positivi risultano blu-viola, quelli Gram-negativi diventano rossi. La colorazione si basa sulla proprietà dei batteri Gram-positivi di mantenere il colore viola nel bagno di alcol (differenziazione), mentre quelli Gram-negativi lo perdono (fig.118). Con la fucsina questi si colorano di rosso. Se si prolunga troppo la differenziazione, anche i batteri Gram-positivi perdono il loro colore. 
11.8.7. Colorazione di Ziehl-Neelsen, E 8
Questa tecnica di colorazione serve per individuare batteri tubercolari. Quando non è certo se le cisti trovate nel tessuto o negli organi siano dovuti a tubercolosi o ad Ichthyophomus, si ricorre a questa colorazione per rendere visibili i batteri tubercolari. In cisti vecchie, tavolta, non vi sono più batteri, perciò si devono sempre allestire preparati per schiacciamento di più cisti. Una volta essiccati all'aria e fissati alla fiamma, i preparati vengono collocati sul sostegno per la colorazione, quindi si ricopre totalmente il vetrino portaoggetto con soluzione di fucsina fenicata di ZIEHL-NEELSEN. Ora si riscalda il vetrino portaoggetto, dal basso, con la fiamma luminosa di un becco di Bunsen, finché dalla soluzione colorante salgono dei vapori. In nessun caso la soluzione deve bollire. Questi vapori fenolici sono nocivi se inalati, ragion per cui si lavora all'aperto oppure davanti a una finestra spalancata. La soluzione va lasciata fumare per tre minuti riscaldando temporaneamente. La soluzione evaporata va riaggiunta, lo striscio non deve restare a secco. Quindi si lascia raffreddare il preparato per un altro minuto e si scola la soluzione colorante. Dopo un lavaggio sotto abbondante acqua corrente, si agita lentamente il vetrino portaoggetto in una bacinella riempita di alcol acidificato con acido cloridrico (preparazione vedi capitolo 11.8.2.) per 60-90 secondi. Quindi si lava nuovamente sotto acqua corrente abbondante. Ora si colora per tre minuti con blu di metilene di LÖFFLER diluito in acqua distillata (1:5). Il colore viene rimosso con acqua distillata e quindi si fa asciugare il preparato all'aria. Dopodichè si aggiunge una piccola goccia di balsamo diluito e si appone un vetrino coprioggetto. I batteri tubercolari ora risultano rossi, mentre gli altri batteri e i frammenti di tessuto sono colorati di blu (fig.119). Se i preparati devono essere conservati, dopo l'essiccazione si pulisce il vetrino portaoggetto fino al vetrino portaoggetto, quindi si luta.
11.8.8. Colorazione semplice dei batteri, E 9

Con la fucsina fenicata di ZIEHL-NEELSEN e il blu di metilene di LÖFFLER si può effettuare una prima colorazione rapida ed intensa dei batteri. Il procedimento è uguale per entrambi i coloranti. Anche i frammenti di tessuto presenti nello striscio si colorano, sicché spesso i batteri contenuti si distinguono con difficoltà. Si lavora secondo le fasi seguenti:
1   Far essiccare all'aria lo striscio sul vetrino portaoggetto per 1-2 ore.
2   Fissare alla fiamma.
3   Aggiungere fucsina fenicata o blu metilene e lasciare agire per 5 minuti.
4   Lavare sotto acqua corrente.
5   Far asciugare all'aria.
6   Montare in balsamo diluito.
I preparati vengono osservati ad ingrandimenti di 300-600 volte.
11.8.9. Colorazione di mucose e sangue, E 10
I raschiati delle mucose, i preparati di sangue e alcuni preparati per schiacciamento tavolta presentano pochissimi contrasti. I parassiti contenuti si distinguono immediatamente, tuttavia la struttura del tessuto, le membrane cellulari e i nuclei non risaltano nel preparato. Se si vogliono vedere maggiori dettagli, lo si deve colorare. E' indicato il blu di metilene di LÖFFLER che, diluito in acqua distillata (1:5), si può conservare in un flacone ben chiuso. Al rischiato posto in acqua sul vetrino portaoggetto, oppure al sangue diluito con soluzione fisiologica di sale da cucina, si aggiunge la stessa quantità di soluzione colorante, si attende un minuto e si copre con un vetrino coprioggetto. Il liquido in eccesso viene rimosso dal bordo del vetrino coprioggetto. I nuclei delle cellule si colorano più intensamente del citoplasma. Colorazioni più deboli si ottengono usando meno soluzione colorante. Se la colorazione dev'essere più intensa, il materiale da esaminare sul vetrino portaoggetto non viene posto in acqua bensì subito nella soluzione colorante. Con questo metodo è stato colorato lo striscio di sangue nella fig. 40. Questa prima colorazione si può praticare anche su molti ciliati.
11.9. La fotografia come mezzo di documentazione
Chi osserva al microscopio, di tanto in tanto scopre nel campo visivo degli oggetti che interessano al tal punto che si vorrebbero conservare per sempre. E' nato il desiderio di fissare quanto visto su una fotografia. Un altro motivo può essere quello che, al momento dell'osservazione, non si è certi di riuscire ad isolare dal preparato a fresco l'oggetto senza danneggiarlo. Soprattutto i parassiti presenti singolarmente possono andare persi con facilità. Il preparato può non riuscire oppure si danneggia l'oggetto.  Eventualmente, una buona foto può addirittura aiutare ad identificare il parassita. Di alcuni oggetti è talmente difficile allestire un preparato, che la fotografia resta l'unico mezzo di documentazione. Per ottenere microfotografie valide, non è necessaria una macchina fotografica speciale. E' adatto qualsiasi reflex  con obiettivo intercambiabile. Molto più importante è l'illuminazione. Ci vuole molta luce e il principio d'illuminazione di Köhler è obbligatorio per foto di prima qualità. Nelle istruzioni d'uso del vostro microscopio potrete leggere come realizzare l'illuminazione di Köhler. Ovviamente, non si possono ottenere buone immagini di preparati di scarsa qualità. Maggiore è l'ingrandimento, più sottili dovranno essere i preparati, poiché aumentando l'ingrandimento la profondità di campo si riduce. Il corpo della macchina fotografica viene attaccato al tubo dell'oculare sul miscroscopio mediante un apposito adattatore. Questi adattatori per il microscopio vengono offerti dalle case produttrici di macchine fotografiche. Inoltre, esistono gli adattatori delle ditte di attrezzatura fotografica, che vengono attaccati al proprio modello di macchina mediante un anello di raccordo (fig. 120). Questo adattatore è composto di tre pezzi. Il pezzo inferiore, più stretto, viene collocato fino al fermo sul tubo del microscopio, dopo averne tolto l'oculare. Ora si rimette l'oculare, al cui tubo si fissa l'adattatore mediante una vite laterale. Il pezzo centrale viene attaccato all'anello di raccordo e sistemato così sulla macchina fotografica. Il tubo di prolunga con la macchina fotografica viene avviato con un giro sul pezzo montato sul microscopio. L'immagine microscopica viene proiettata sul vetrino smerigliato (schermo di messa a fuoco) della macchina fotografica e, osservando attraverso il mirino, si focalizza con la manopola per il movimento micrometrico sul microscopio. Per la messa a fuoco, è di grande aiuto un mirino regolabile (a rotazione di 360°), con oculare di correzione. Una volta attaccato questo dispositivo al corpo macchina, l'oculare viene regolato finchè sullo schermo di messa  a fuoco la zona centrale a reticolo (croci, microprismi, ecc.) non appare perfettamente nitida. Proiettando sullo schermo di messa a fuoco un'immagine dell'oggetto focalizzata mediante la manopola per il movimento micrometrico, anche la foto risulterà a fuoco. Nell'usare la macchina fotografica, si tengono presenti alcuni punti. In linea di principio, qualsiasi macchina reflex monoculare è adatta per la microfotografia. In pratica, vengono tuttavia usati di solito i modelli con esposimetro incorporato. Nei modelli più recenti questo cosiddetto esposimetro TTL regola il tempo di esposizione automaticamente, mediante un computer, oppure si legge il valore nel mirino e lo si imposta manualmente. Con entrambi i sistemi è talvolta necessario correggere il tempo di esposizione indicato, poiché dalle zone chiare e quelle scure nell'immagine la misurazione stabilisce un valore medio. Nella maggior parte delle macchine fotografiche è incorporato questo sistema di misurazione integrale. Solo pochi modelli offrono una misurazione a spot, con cui la luce viene misurata solamente su una superficie ridotta del campo inquadrato. Prima di ogni scatto, si deve fare attenzione al rapporto di dimensioni tra oggetto e superficie dell'immagine completa, nonché alla presenza di forti contrasti. Quando nelle immagini in campo chiaro l'oggetto è più scuro dello sfondo, si agisce sul meccanismo di compensazione di esposizione (a seconda del modello, si trova vicino alla ghiera per l'impostazione della sensibilità della pellicola) in direzione positiva. Nelle immagini in campo oscuro, invece, l'oggetto è molto più chiaro dello sfondo: si deve correggere in direzione negativa. Siccome il sistema di misurazione tiene conto sia delle zone chiare sia di quelle scure nell'immagine per poi calcolare un valore medio, il tempo di esposizione deve essere aumentato o diminuito, per esporre in maniera corretta le parti determinanti dell'immagine. L'entità della correzione dipende da due valori: le dimensioni dell'oggetto e la differenza di luminosità tra oggetto e sfondo dell'immagine. Per le immagini in campo chiaro i tempi di esposizione vengono allungati, per le immagini in campo oscuro, invece, accorciati. Per quanto concerne la pellicola fotografica, le differenze di qualità sono minime. Oggi si fotografa generalmente con pellicole per diapositive (invertibili). Più alto è il valore ASA, più grossa è la grana della pellicola. I valori più comuni sono compresi tra 50 e 200  ASA. Di grana molto fine, per tempi di esposizione lunghi, sono le pellicole da 25 ASA. Molti professionisti lavorano con pellicole in bianco e nero, poiché anche con un elevato valore ASA sono di grana molto fine. Per aumentare il contrasto nelle immagini in bianco e nero, si colloca nel percorso ottico un filtro verde. La riproduzione cromatica di una pellicola a colori dipende non tanto dal materiale quanto dal filtro colorato da porre nel percorso ottico del microscopio. La scelta di questo filtro dipende, a sua volta, dalla temperatura dei colori dell'illuminazione. Si consultino a tale proposito le istruzioni allegate al microscopio oppure il rivenditore. Se si vogliono scattare microfotografie con tempi di esposizione brevi (oggetti mobili), oppure a ingrandimenti elevati, è necessaria una fonte luminosa intensa. Per gli ingrandimenti bassi è sufficiente la lampada a basso voltaggio incorporata nei microscopi abbastanza sofisticati. In caso di ingrandimenti più alti, gli oggetti non devono più muoversi. A tale scopo si colloca presso il bordo del vetrino coprioggetto una goccia di formalina o di soluzione fissatrice-colorante (E 6) e con della carta assorbente si rimuove un po' di liquido dall'altro lato del vetrino. Con ingrandimenti molto elevati i tempi di esposizione saranno molto più lunghi di quanto l'automatismo possa impostare. Allora si devono scattare delle fotografie di prova, raddoppiando di posa in posa il tempo di esposizione. Dopo aver sviluppato la pellicola si sceglierà il valore più adatto. I microscopi che dispongono di uno specchio possono essere illuminati con un proiettore di diapositive. Se l'illuminazione del campo visivo non è uniforme, si pone nel cono luminoso tra proiettore e specchio del microscopio una sorta di vetro opalino. A tale scopo è molto indicata la carta da luci (per disegno; in cartoleria), al limite anche la carta oleata per alimenti. Dopo aver ritirato la pellicola sviluppata, ben pochi si ricorderanno i dati esatti delle singole immagini. Perciò è assolutamente necessario prendere nota subito dopo ogni scatto dei valori più importanti. Questi si potranno poi riportare su telaietti delle diapositive. E' meglio segnare le informazioni subito su apposite schede. La scheda di una diapositiva riuscita otterrà poi lo stesso codice segnato sul telaietto, sul verbale con le informazioni sulla dissezione e sul preparato permanente eventualmente allestito in un secondo momento. Sulle schede delle fotografie vanno indicati i seguenti dati: codice d'archivio, nome dell'oggetto, data dall'immagine, numero della pellicola (quando se ne è utilizzata più di una), numero della posa, marca della pellicola, valore ASA, valore della compensazione di esposizione, ingrandimento al microscopio, regolazione dell'illuminazione, filtro, posizione del diaframma del condensatore, tipo di osservazione (in campo chiaro, in campo oscuro, a contrasto di fase), ingrandimento proprio dell'obiettivo,  ingrandimento proprio dell'oculare, ingrandimento sulla diapositiva, dimensioni dell'oggetto espresse in micrometri. Sull'altra facciata della scheda c'è lo spazio per disegni, osservazioni, appunti. Grazie allo stesso codice d'archivio, sarà facile reperire tutti i dati relativi ad un determinato oggetto. Quando si spediscono diapositive, ad esempio per richiedere informazioni, le dimensioni degli oggetti fotografati – lo ricordiamo – vanno sempre indicate in micrometri e non tramite l'ingrandimento al microscopio. ...Home»

Fonte: libro "Malattie dei pesci d'acquario" del Dott.Dieter Untergasser del 1989 non più in commercio in Italia. MGA©